Após o isolamento de uma informação genética, por exemplo um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrição, este fragmento deverá ser inserido numa outra molécula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informação genética em centenas de cópias. Este processo de amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que são os chamados vetores de clonagem molecular.
Atualmente, os tipos básicos de vetores usados na metodologia do DNA recombinante apresentam características especiais que os tornam excelentes veículos de clonagem em diferentes situações.
A seguir daremos uma ênfase maior na utilização do vetor plasmídeo.
PLASMÍDEO
São pequenas moléculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessários para a sua replicação e pelo menos um gene que confere resistência a antibiótico. Estes elementos genéticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente estão presentes em duas ou mais cópias por célula. Os plasmídeos presentes num grande número de cópias são usados como veículos de clonagem desde que capacitem a amplificação do segmento do DNA neles clonado.
Um plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes propriedades:
a) possuir uma origem de replicação (O), ou seja, uma seqüência de DNA que permita que o vetor seja replicado na célula hospedeira,
b) apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para endonucleases de restrição. O conjunto destes sítios é denominado de Múltiplo Sítios de Clonagem (MSC) é o local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem,
c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a célula transformada da célula não transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistência à ampicilina (AmpR). As células transformadas com tais vetores são capazes de crescer num meio contendo o antibiótico, enquanto que as células não tranformadas acabam morrendo.
Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular é o uso de enzima de restrição que produz extremidades compatíveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor).
Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molécula híbrida deverá ser introduzida numa célula hospedeira geralmente bactérias, por um processo chamado de transformação, para que o vetor possa sofrer replicações e consequentemente amplificar o número de cópias do inserto. A bactéria transformada será facilmente reconhecida pela aquisição de um novo fenótipo dado pelo plasmídeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibiótico.
Bibliografia:
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